Модульная единица 7. Ферменты.

Рассматриваемые вопросы.

Лекция 4. Ферменты.

Аннотация.

Излагаются строение, свойства и механизм действия ферментов. Указываются основные показатели, выражающие их каталитическую активность, а также активаторы и ингибиторы ферментов. Даются сведения об изоферментах, локализации ферментов и особеностях функционирования ферментных систем. Рассматриваются механизмы регуляции конститутивных ииндуцибельных ферментов. Объясняются принципы классификации ферментов и зависимость их активности от различных физиологических условий.

Ключевые слова: ферменты, каталитический (активный) центр фермента, гипотеза замка и ключа, гипотеза индуцированного соответствия, коферменты, железо-серные белки, катал, удельная и молярная активность ферментов, период полужизни фермента, изоферменты, константа Михаэлиса, активаторы и ингибиторы ферментов, конкурентные и неконкурентные ингибиторы, белковые ингибиторы ферментов, мультиферментные системы, конститутивные и индуцибельные ферменты, аллостерические ферменты, зимогены (проферменты), гормональная регуляция активности ферментов, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы).

1. Механизм действия ферментов.

2. Строение двухкомпонентных ферментов.

3. Каталитическая активность ферментов.

4. Изоферменты.

5. Изменение активности ферментов в зависимости от условий среды.

6. Локализация ферментов.

7. Регуляция ферментативных реакций.

8. Классификация ферментов.

Цели и задачи изучения модульной единицы. Изучить строение, свойства и механизм действия ферментов, особенности регуляции ферментативных реакций и функционирования ферментных систем. Научить студентов использовать сведения о ферментах для прогнозирования интенсивности и направленности биохимических процессов в растениях при обосновании технологий выращивания сельскохо-зяйственных культур.

В живых клетках самопроизвольно и с очень высокой скоростью происходят химические реакции, обеспечивающие жизнедеятельность организмов. Эти реакции довольно легко протекают при атмосферном давлении, сравнительно невысоких температурах и концентрациях веществ. Они проходят строго согласованно в пространстве и времени и в соответствии с потребностями живого организма. Для их осуществления вне организма потребовалось бы создание высокой температуры или давления, сильно кислой или щелочной среды, воздействие каких-либо других жестких факторов, которые не совместимы с функционированием живых клеток.

Нормальное осуществление биохимических реакций в живых организмах оказывается возможным благодаря тому, что в их клетках имеются биологические катализаторы, называемые ферментами . Название ферменты происходит от латинского слова fermentum (закваска). В научной литературе для ферментов очень часто используют также другое название – энзимы , а учение о ферментах называют энзимологией.

Подавляющие большинство ферментов представляют собой специализированные формы белковых молекул, способные катализировать химические превращения в живых организмах. Однако, как установлено, каталитической активностью могут обладать и структурные белки, входящие в состав клеточных мембран, а также некоторые формы РНК, которые рассматриваются как эволюционные предшественники белковых катализаторов.

По современным представлениям почти все химические реакции в живых организмах происходят с участием ферментов, которые способны ускорять биохимические превращения в тысячи и даже в миллионы раз. Ферменты характеризуются высокой степенью избирательности и направленности действия, что обеспечивает чистый выход продуктов реакции практически без примесей.

Как и любые катализаторы, ферментные белки участвуют в биохимических реакциях, но не входят в состав образующихся продуктов. В ходе реакции они ускоряют взаимодействие реагирующих веществ. В обратимом превращении фермент ускоряет как прямую, так и обратную реакцию, не смещая химического равновесия.

Одно и то же химическое вещество в каждой конкретной реакции имеет совершенно определённую энергию активации. Чем выше энергия активации, тем труднее вещество вступает в химическую реакцию, поэтому скорость реакции будет очень низкой. В таких условиях для ускорения химического превращения реагирующих веществ в продукты реакции применяют катализаторы. В биохимических превращениях роль катализаторов выполняют ферментные белки.

С участием фермента биохимическая реакция направляется обходным путём, через промежуточные стадии, для осуществления которых требуется значительно меньшая энергия активации, вследствие чего такие превращения проходят с очень высокой скоростью. Так, например, происходит реакция: А + Б ® АБ, в ходе которой из реагирующих веществ А и Б образуется продукт АБ. В этой реакции и реагент А, и реагент Б характеризуются высокой энергией активации, поэтому данная реакция происходит медленно. Но если включается в действие фермент (Ф), то он образует промежуточное соединение с одним из реагирующих веществ: А + Ф ® АФ. При этом энергия активации вещества А в данной реакции значительно ниже, чем в первой, которая осуществляется без участия фермента, вследствие чего синтез промежуточного продукта АФ будет проходить с высокой скоростью (рис . 15). В ходе превращения промежуточное соединение АФ взаимодействует с веществом Б, образуя продукт АБ, а фермент регенерируется в неизменном виде: АФ + Б ® АБ + Ф. В рассматриваемой промежуточной реакции энергия активации вещества Б намного меньше, чем в первой реакции, поэтому образование продукта АБ будет идти с высокой скоростью. Таким образом, синтез продукта АБ с участием фермента осуществляется в две стадии, но они проходят намного быстрее, чем взаимодействие веществ А и Б без участия фермента.

В биохимии принято называть вещества, подвергающиеся превращению с участием ферментов, субстратами . В ходе ферментативной реакции субстрат взаимодействует с молекулой фермента, образуя активированный комплекс, который называют фермент –субстратным комплексом . Поскольку ферменты являются белковыми молекулами, имеющими высокую молекулярную массу и сравнительно крупные размеры, а субстраты – чаще всего низкомолекулярные вещества, при образовании фермент–субстратного комплекса субстрат реагирует с определённым участком белковой молекулы фермента, называемым каталитическим или активным центром .

В процессе образования фермент–субстратного комплекса фермент оказывает активирующее воздействие на молекулу субстрата, в результате чего возрастает его реакционная способность и он легко превращается в продукты реакции. При этом молекула фермента высвобождается и затем может вновь реагировать с новой молекулой субстрата. Образование и распад фермент–субстратного комплекса происходит очень быстро, обеспечивая высокую скорость ферментактивного превращения. В разных опытах было определено, что одна молекула фермента способна катализировать превращение десятков и даже сотен тысяч молекул субстрата за 1 секунду.

Активный центр фермента обычно включает от 3 до 12 аминокислотных остатков, находящихся в разных участках аминокислотной последовательности первичной структуры ферментного белка, но сближающихся в пространстве при формировании третичной структуры белковых полипептидов (рис . 16). Однако строгой границы, отделяющей активный центр от остальной части молекулы фермента не существует, так как образующие его аминокислотные остатки являются неотъемлемой частью общей структуры белка–фермента.

В активном центре фермента имеются группировки, ответственные за связывание субстрата, и образование фермент–субстратного комплекса, но вместе с тем они также обеспечивают правильную пространственную ориентацию молекулы субстрата по отношению к другим группировкам активного центра, участвующим в превращении субстрата. При этом происходит совместное и кооперативное действие на субстрат всех функциональных группировок активного центра.

В процессе образования фермент–субстратного комплекса происходит очень точное распознование ферментом молекул субстрата вследствие того, что поверхности молекул субстрата и каталитического центра фермента комплементарны, то есть субстрат по своей пространственной конфигурации структурно совместим с каталитическим центром фермента. Такое структурное соответствие между ферментом и субстратом хорошо объясняется гипотезой замка и ключа , согласно которой субстрат по форме так подходит к активному центру фермента, как ключ к замку. При этом субстрат сравнивается с ключом, а фермент с замком.

Из огромного разнообразия химических веществ, содержащихся в клетках живого организма, только субстрат способен связываться с активным центром фермента. Обычно фермент катализирует превращение группы структурно родственных соединений. Например, липаза катализирует гидролитическое расщепление различных сложных эфиров глицерина, входящих в состав жиров; пепсин - катализирует гидролиз различных белков, амилазы – гидролиз полисахаридов крахмала, нуклеотидазы - расщепление нуклеотидов. Однако известны ферменты, обладающие очень узкой специфичностью действия. Например, каталаза катализирует превращение только пероксида водорода, уреаза – гидролиз мочевины, сукцинатдегидрогеназа – отщепление водорода от молекул янтарной кислоты (сукцината).

Очень важное свойство ферментов – их стереохимическая специфичность. В целом ряде опытов было чётко показано, что ферменты способны распознавать не только геометрию субстрата, но также правую и левую стороны его молекулы или даже атомы водорода в составе СН 2 – группы, по-разному ориентированные в пространстве. Поэтому каждый фермент катализирует превращение только определённых стереоизомеров органических веществ. И это имеет важное биологическое значение. Как указывалось ранее, в организмах синтезируются преимущественно D – формы моносахаридов и L -формы аминокислот, в связи с чем именно эти стереоизомеры указанных соединений могут служить субстратами для ферментов, тогда как другие стереоизомеры не могут превращаться ферментами организма.

Изучение ферментативных реакций показывает, что специфичность действия ферментов выражается не только в комплементарном связывании субстратов, но и направленном их превращении в определённые продукты реакции, так как из одного и того же субстрата могут быть получены разные вещества. Таким образом, в ходе превращения фермент специфически связывает субстрат и одновременно определяет направление биохимической реакции.

В процессе образования фермент–субстратного комплекса активные радикалы аминокислотных остатков, находящиеся в каталитическом центре фермента, определенным образом воздействуют на молекулу субстрата. При этом возможна поляризация и растяжение связей, ионизация отдельных группировок и их смещение в пространстве, что создает напряжение в молекуле субстрата, вызывающее перестройку её структуры, в результате чего молекула субстрата переходит в активированное состояние и легко подвергается превращению. При этом образующиеся продукты уже не имеют структурного сродства с активным центром фермента и вытесняются новыми молекулами субстрата.

Чаще всего между субстратом и группировками активного центра фермента происходят электростатические взаимодействия за счёт образования водородных связей и участия вандер-ваальсовых сил, поэтому образование фермент–субстратного комплекса представляет собой легкообратимый процесс, что способствует быстрому прохождению ферментативного превращения. Однако в ряде ферментативных реакций группировки активного центра образуют ковалентные связи с молекулами субстратов, переводя их в более реакционноспособное состояние. Так, например, действуют ферменты, катализирующие реакции нуклеофильного замещения, в ходе которых осуществляется перенос метильных, ацильных и фосфатных групп, остатков моносахаридов, аминокислот, нуклеотидов.

В некоторых реакциях ведущим фактором перевода субстрата в активированное состояние является дегидратация, то есть создание в активном центре фермента такой внутренней среды, которая лишает субстрат контакта с молекулами воды, препятствующими прохождению данной ферментативной реакции.

При взаимодействии фермента с субстратом происходят не только конформационные изменения молекулы субстрата, но и белка–фермента. Такой тип взаимодействия объясняется гипотезой индуцированного соответствия , согласно которой предполагается, что в ходе образования фермент–субстратного комплекса аминокислотные остатки в активном центре фермента приобретают такую пространственную ориентацию, которая позволяет ферменту наиболее эффективно выполнять каталитическую функцию. Очень часто в процессе такого взаимодействия аминокислотные радикалы фермента определенным образом укладываются вокруг молекулы субстрата, создавая в активном центре специфическую внутреннюю среду, способствующую активации субстрата и его превращению в продукты реакции.

В состав каталитического центра ферментных белков входят радикалы аминокислот, имеющих реакционноспособные группировки, которые могут быть донорами или акцепторами протонов. С их участием инициируется отщепление и присоединение протонов к молекуле субстрата, или происходит перенос протонов, в результате чего изменяется состояние ионизации молекулы субстрата и её кислотно-основные свойства и таким образом усиливается реакционная способность субстрата.

Донорами протонов в составе аминокислотных радикалов являются группировки, у которых атомы водорода соединены с электроотрицательными атомами (O, N, S), или группировки, присоединившие протон: –COOH, –CH 2 OH, –OH, –SH, –NH 3 + , >NH 2 + , ≥NH + . Акцепторами протонов могут служить следующие функциональные группы: –СОО‾, –NH 2 , > NH–, ≥N.

Носителями указанных реакционноспособных групп в молекуле белка–фермента являются радикалы моноаминодикарбоновых и диаминомонокарбоновых кислот, серина, цистеина, тирозина, гистидина, триптофана.

Для выяснения строения каталитического центра фермента необходимо установить последовательность соединения аминокислотных остатков в его пептидных цепях, степень олигомерности белковой молекулы и её пространственную структуру, а также определить аминокислотные радикалы, участвующие в каталитическом действии фермента. При этом показано, что некоторые олигомерные ферментные белки могут иметь каталитический центр в каждой полипептидной субъединице.

В результате проведенных исследований расшифрована структура и изучено действие многих ферментов. В качестве примера рассмотрим строение активного центра и вероятный механизм действия фермента триозофасфатизомеразы, выделенного из клеток трипаносом (одна из форм одноклеточных животных). Этот фермент катализирует изомерные превращения фосфодиоксиацетона и 3-фосфоглицеринового альдегида.

Молекула триозофосфатизомеразы образуется из двух одинаковых полипептидных субъединиц, включающих по 250 аминокислотных остатков. Каждый такой полипептид имеет на поверхности третичной структуры восемь a-спиралей, а во внутреннем пространстве систему из восьми b-структур, образующих внутреннюю полость (рис. 10). Активными группировками каталитического центра данного фермента являются радикал лизина, занимающий 13-тое положение в аминокислотной последовательности ферментного белка (считая от N-конца), остаток гистидина, находящийся в 95-ом положении, и остаток глутаминовой кислоты в положении 167. Однако в каталитическом действии также участвуют другие аминокислотные остатки, образующие внутреннее пространство молекулы фермента. Хотя активный центр формируется в структуре каждого полипептида, тем не менее, не ассоциированные в молекулу полипептидные субъединицы триозофосфатизомеразы каталитической активностью не обладают. Они способны катализировать биохимическое превращение только в том случае, когда соединяются в димеры, образующие молекулы фермента.

Рассмотрим механизм ферментативного превращения фосфодиоксиацетона в 3-фосфоглицериновый альдегид:

CH 2 O(Р) триозофосфатизомераза CH 2 O(P)

½ ¾¾¾¾¾¾¾¾¾® ‌

В процессе образования фермент–субстратного комплекса фосфатная группа фосфодиоксиацетона образует водородные связи с электроотрицательными группировками активного центра фермента и электростатически взаимодействует с положительно заряженной аминогруппой аминокислотного остатка Lys 13 (R-СН 2 NH 3), при этом в

молекуле фермента происходит изменение пространственной структуры участка полипептидной цепи, включающего аминокислотные остатки в положениях 167®178 (показано на стр. 217). Такое изменение конформации активного центра приводит к замыканию внутренней полости в третичной структуре полипептида и защищает субстрат от воздействия на него молекул воды и других веществ из внешнего раствора.

После образования фермент–субстратного комплекса молекула фосфодиоксиацетона в активном центре фермента оказывается в непосредственной близости от имеющей отрицательный заряд карбоксильной группы аминокислотного остатка глутаминовой кислоты Glu 167 , вследствие чего между ними происходит взаимодействие. В результате такого взаимодействия от первого углеродного атома фосфодиоксиацетона отщепляется протон и присоединяется к карбоксильной группе Glu 167 , а между первым и вторым углеродными атомами субстрата замыкается двойная связь. При этом одновременно происходит разрыв двойной связи в кетонной группировке и электростатическая стабилизация отрицательного заряда кислорода положительным зарядом аминной группировки остатка лизина Lys 13 . В стабилизации молекулы субстрата также важную роль играет атом азота гетероциклического радикала гистидина His 95 , образующего водородную связь с гидроксильной группой субстрата.

В ходе указанной перегруппировки образуется неустойчивое промежуточное соединение, у которого углеродные атомы с двойной связью соединены с гидроксильными группами. Оно способно самопроизвольно превращаться в более устойчивую альдегидную форму, а двойная связь между первым и вторым углеродными атомами подвергается разрыву, инициируя перенос протонов к возникающим свободным связям. В ходе такой перегруппировки ко второму углеродному атому субстрата переходит протон от карбоксильной группы глутаминовой кислоты, а к соединенному с ним атому кислорода с участием гистидинового радикала фермента осуществляется перенос протона от гидроксильной группы первого углеродного атома и, таким образом, молекула фосфодиоксиацетона превращается в 3-фосфоглицериновый альдегид, который и является продуктом рассматриваемого биохимического превращения. Этот же фермент может катализировать обратную реакцию изомеризации 3-фосфоглицери-нового альдегида в фосфодиоксиацетон.

Направленность реакции изомеризации, катализируемой триозофосфатизомеразой, определяется тем, какой из биохимических продуктов (кетонная или альдегидная форма) используется для дальнейших превращений, вследствие чего происходит соответствующий сдвиг химического равновесия.

У многих ферментов в составе каталитического центра имеются не только реакционноспособные радикалы аминокислотных остатков, но и дополнительные активные группировки неаминокислотной природы, присутствие которых строго необходимо для выполнения ферментом его каталитической функции. В соответствии с наличием или отсутствием в активном центре фермента дополнительной активной группировки неаминокислотной природы молекулы фермента называют однокомпонентными или двухкомпонентными . У однокомпонентных ферментов каталитический центр образуется только из аминокислотных остатков белка и не содержит каких-либо других небелковых компонентов. У двухкомпонентных ферментов в структуре активного центра имеется небелковая группировка, которая или непосредственно взаимодействует с субстратом, или воздействует на структуру каталитического центра, переводя его в активное состояние.

Механизм действия простого и сложного ферментов одина­ков, так как активные центры в их молекулах выполняют сходные функции.

Основы механизма действия ферментов были изучены в начале XX в. В 1902 г. английский химик А.Браун высказал предположение о том, что фермент, воздействуя на субстрат, должен образовать с ним промежуточный фермент - субстратный комплекс. Одновре­менно и независимо от А. Брауна это же предположение высказал французский ученый В. Анри. В 1913 г. Л. Михэлис и М. Ментэн подтвердили и развили представления о механизме действия фер­ментов, который можно представить в виде схемы:

где Е - фермент, S - субстрат, Р - продукт.

На первой стадии ферментативного катализа происходит обра­зование фермент-субстратного комплекса, где фермент и субстрат могут быть связаны ионной, ковалентной или иной связью. Обра­зование комплекса ES происходит практически мгновенно.

На второй стадии субстрат под воздействием связанного с ним фермента видоизменяется и становится более доступным для соот­ветствующей химической реакции. Эта стадия определяет скорость всего процесса.

На третьей стадии происходит химическая реакция, в результате которой образуется комплекс продукта реакции с ферментом.

Заключительным процессом является высвобождение продук­та реакции из комплекса.

Эту схему можно проиллюстрировать конкретным примером. Рассмотрим механизм действия аминотрансфераз, катализирующих процесс переаминирования амино- и кетокислот. Аминотрансфе-раза - холофермент, коферментом которого является пиридок-сальфосфат, связанный ковалентно с апоферментом. Активной группой, принимающей участие в катализе, является альдегид­ная группа кофермента, поэтому для простоты изображения ме­ханизма действия фермента обозначим холофермент cледующим образом.

На первой стадии ферментативного катализа происходит обра­зование ферментсубстратного комплекса , в котором фер­мент и субстрат связаны ковалентной связью:

На второй стадии происходит преобразование субстрата, вы­ражающееся в таутомерной перегруппировке, что приводит к об­разованию комплекса ":

В результате химической реакции (в данном случае происходит гидролиз) образуется кетокислота, а фермент высвобождается из комплекса в виде пиридоксаминфермента. Чтобы не нарушался один из основных принципов катализа, в данном процессе при­нимает участие кетокислота. Последующий процесс можно пред­ставить следующей схемой:

Данный пример не только иллюстрирует механизм действия фермента, но и дает представление о том, что биохимический процесс можно выразить в виде цепи простых химических пре­вращений субстрата.

Любая каталитическая реакция предполагает изменение скоростей как прямой, так и обратной реакции за счет снижения ее энергетики. Если хими­ческая реакция протекает с выделением энергии, то она должна начинаться спонтанно. Однако этого не происходит, потому что компоненты реакции должны быть переведены в активированное (переходное) состояние. Энергия, необходимая для перевода реагирующих молекул в активированное состояние, называется энергией активации . Переходное состояние характери­зуется непрерывным образованием и разрывом химических связей, причем между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие. Скорость прямой реакции зависит от температуры и разности значений свободной энергии для субстрата в переходном и основном состоя­ниях. Эта разность называется свободной энергией реакции.

Достижение переходного состояния субстрата возможно двумя путями: за счет передачи реагирующим молекулам избыточ­ной энергии (например, за счет увеличе­ния температуры) или снижения энергии активации соответствующей химической реакции (рисунок 2.8).

Ферменты «помогают» субстратам принять переходное состояние за счет энергии связывания при образовании фермент-субстратного комплекса. Сни­жение энергии активации при фермента­тивном катализе обусловлено увеличе­нием числа стадий химического процес­са. Индуцирование ряда промежуточных реакций приводит к тому, что исходный активационный барьер дробится на несколько более низких барьеров, преодо­леть которые реагирующие молекулы могут гораздо быстрее, чем основной.

Механизм ферментативной реакции можно представить следу­ющим образом:

1) соединение фермента (Е) и субстрата (S) с образованием не­стойкого фермент-субстратного комплекса (ES): Е + S ® E-S;

2) образование активированного переходного состояния: Е-S ® (ES)*;

3) высвобождение продуктов реакции (Р) и регенерация фермен­та (Е): (ES)* ® Р + Е.

Для объяснения высокой эффективности действия энзимов было предложено несколько теорий механизма ферментативного катализа. Наиболее ранней является теория Э. Фишера (теория «шаблона» или «жесткой матрицы»). Согласно этой теории фермент является жест­кой структурой, активный центр которой представляет собой «сле­пок» субстрата. Если субстрат подойдет к активному центру фермен­та как «ключ к замку», то произойдет химическая реакция. Эта тео­рия хорошо объясняет два типа субстратной специфичности фермен­тов - абсолютную и стереоспецифичность, но оказывается несостоя­тельной при объяснении групповой (относительной) специфичности ферментов.

Теория «дыбы» основана на представлениях Г. К. Эйлера, изучав­шего действие гидролитических ферментов. По этой теории фермент связывается с молекулой субстрата в двух точках, при этом происходит растяжение химической связи, перераспределение элек­тронной плотности и разрыв химической связи, сопровождающий­ся присоединением воды. Субстрат до присоединения к ферменту имеет «расслабленную» конфигурацию. После связывания с активным центром молекула субстрата подвергается растяжению и деформации (располагается в активном центре как на дыбе). Чем больше длина химических связей в субстрате, тем легче они разрываются и тем меньше энергия активации химической реакции.

В последнее время нашла широкое распространение теория «ин­дуцированного соответствия» Д. Кошланда, которая допускает высо­кую конформационную лабильность молекулы фермента, гибкость и подвижность активного центра. Субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата простран­ственную ориентацию, т. е. субстрат подходит к активному центру как «рука к перчатке».

Согласно теории индуцированного соответствия механизм взаи­модействия фермента и субстрата следующий:

1. фермент по принципу комплементарности распознает и «ловит» молекулу субстрата. В этом процессе белковой молекуле помога­ет тепловое движение ее атомов;

2. аминокислотные остатки активного центра смещаются и под­страиваются по отношению к субстрату;

3. химические группировки ковалентно присоединяются в активном центре - ковалентный катализ .

Кинетика ферментативных реакций. Кинетика изучает скорости, механизмы реакций и влияние на них таких факторов, как концентрации ферментов и субстратов, темпера­тура, рН среды, присутствие ингибиторов или активаторов.

При постоянной концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (рисунок 2.9, а). График зависимости скорости ферментативной реакции от кон­центрации субстрата имеет вид равнобочной гиперболы (рисунок 2.9, б).

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса - Ментен:

,

где V - стационарная скорость биохимической реакции; V max - максимальная скорость; К m - константа Михаэлиса; [S] - концен­трация субстрата.

а

б

Рисунок 2.9 - Зависимость скорости ферментативной реакции от

концентрации фермента (а) и субстрата (б)

Если концентрация субстрата низкая, т. е. [S] << К m , то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Таким образом, при низких концентраци­ях субстрата скорость реакции прямо пропор­циональна концентрации субстрата и описы­вается уравнением первого порядка. Это со­ответствует начальному прямолинейному уча­стку кривой V = f [S] (рисунок 2.9, б).

При высоких концентрациях субстрата [S] >> К m , когда К m можно пренебречь, уравнение Михаэлиса - Ментен приобретает вид

Т.е. V=V max .

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость реакции стано­вится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка. Это соответствует участку кривой V =f [S], параллельному оси абсцисс.

При концентрациях субстрата, численно сравнимых с констан­той Михаэлиса, скорость реакции возрастает постепенно. Это вполне согласуется с представлениями о механизме ферментативной реак­ции:

S + Е ES Р + Е

где S - субстрат; Е - фермент; ES - фермент-субстратный комп­лекс; Р - продукт; k 1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k 2 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием исходных реагентов; k 3 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с обра­зованием продукта.

Скорость превращения субстрата с образованием продукта (Р) про­порциональна концентрации фермент-субстратного комплекса . При малых концентрациях субстрата в растворе имеется некоторое число свободных молекул фермента (Е), не связанных в комплекс (ES). Поэтому при увеличении концентрации субстрата концентрация ком­плексов растет, следовательно, растет и скорость образования продук­та. При больших концентрациях субстрата все молекулы фермента связаны в комплекс ES (явление насыщения фермента), поэтому даль­нейшее повышение концентрации субстрата практически не увеличи­вает концентрацию комплексов и скорость образования продукта остается постоянной.

Таким образом, становится ясен физический смысл максимальной скорости ферментативной реакции . V m ах - это скорость, с которой реагирует фермент, полностью существующий в виде фермент-суб­стратного комплекса.

Константа Михаэлиса численно соответствует такой концентра­ции субстрата, при которой стационарная скорость равна половине максимальной (см. рисунок 2.9, б). Данная константа характеризует кон­станту диссоциации фермент-субстратного комплекса:

Физический смысл константы Михаэлиса в том, что она характе­ризует сродство фермента к субстрату. К m имеет малые значения, когда k 1 >(k 2 + k 3), т.е. процесс образования комплекса ES преоб­ладает над процессами диссоциации ES. Следовательно, чем меньше значения К m , тем сродство фермента к субстрату больше. И, наобо­рот, если К m имеет большое значение, то (k 2 + k 3) > k 1 и процессы диссоциации ES преобладают. В этом случае сродство фермента к субстрату небольшое.

Ингибиторы и активаторы ферментов. Ингибиторами ферментов называются вещества, снижающие активность ферментов. Любые денатурирующие агенты (например, соли тяжелых металлов, кислоты) являются неспецифическими ингибито­рами ферментов.

Обратимые ингибиторы - это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом. Необратимые ингибиторы - это соединения, специфически связывающие функциональные группы активного центра и образующие ковалентные связи с ферментом.

Обратимое ингибирование разделяют на конкурентное и неконку­рентное. Конкурентное ингибирование предполагает структурное сход­ство ингибитора и субстрата. Ингибитор занимает место в активном центре фермента, и значительное количество молекул фермента ока­зывается блокировано. Конкурентное ингибирование можно снять, если повысить концентрацию субстрата. В этом случае субстрат вы­тесняет конкурентный ингибитор из активного центра.

Обратимое ингибирование может быть неконкурентным в отноше­нии субстрата. В этом случае ингибитор не конкурирует за место присоединения к ферменту. Субстрат и ингибитор связываются с раз­ными центрами, поэтому появляется возможность образования комп­лекса IE, а также и тройного комплекса IES, который может распа­даться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комп­лекс ES.

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на спе­цифические и неспецифические.

Специфические ингибиторы оказывают свое действие на фермент, присоединяясь ковалентной связью в активном центре фермента и выключая его из сферы действия.

Неспецифическое ингибирование предполагает воздействие на фер­мент денатурирующих агентов (солей тяжелых металлов, мочевины и др.). В этом случае в результате разрушения четвертичной и третич­ной структуры белка происходит потеря биологической активности фермента.

Активаторы ферментов - это вещества, увеличивающие скорость фермен­тативной реакции. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы метал­лов (Fe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , Co 2+ , Mn 2+ , Mg 2+ и т.д.). Различают металлы, находящиеся в составе металлоферментов, являющиеся кофакторами, и вы­ступающие в качестве активаторов ферментов. Кофакторы могут прочно связы­ваться с белковой частью фермента, что же касается активаторов, то они легко отделяются от апофермента. Такие металлы являются обязательными участника­ми каталитического акта, определяющими активность фермента. Активаторы уси­ливают каталитическое действие, но их отсутствие не препятствует протека­нию ферментативной реакции. Как правило, металл-кофактор взаимодейству­ет с отрицательно заряженными группировками субстрата. Металл с переменной валентностью принимает участие в обмене электронов между субстратом и ферментом. Кроме того, они принимают участие в образовании ста­бильной переходной конформации фермента, что способствует более быстро­му образованию ES комплекса.

Регуляция активности ферментов. Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Одним из примеров является аллостерическая регуляция, регуляция посредством активаторов и ингибиторов. Часто бывает так, что конечный продукт метаболического пути является ингибитором регуляторного фермента. Такой тип ингибирования называется ретроингибированием , или ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Многие ферменты вырабатываются в виде неактивных предше­ственников-проферментов, а затем в нужный момент активируются за счет частичного протеолиза. Частичный протеолиз - отщепление части молекулы, которое приводит к изменению третичной структуры белка и формированию активного центра фермента.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять свою активность за счет ассоциации - диссоциации субъединиц, входящих в их со­став.

До последнего времени считалось, что абсолютно все ферменты являются веществами белковой природы. Но в 80-е годы была обнаружена каталитическая активность у некоторых низкомолекулярных РНК. Эти ферменты назвалирибозимами . Остальные, свыше 2000 известных в настоящее время ферментов, имеют белковую природу и характеризуются всеми свойствами белков.

По строению ферменты делятся на:

1.простые или однокомпонентные;

2.сложные или двухкомпонентные (холоферменты).

Простые ферменты представляют собой простые белки и при гидролизе распадаются только на аминокислоты. К числу простых ферментов относятся гидролитические ферменты (пепсин, трипсин, уреаза и др.).

Сложные белки являются сложными белками и, помимо, полипептидных цепей содержат небелковый компонент (кофактор ). К сложным белкам относится большинство ферментов.Белковая часть двухкомпонентного фермента называется апоферментом. Кофакторы могут иметь различную прочность связи с апоферментом.Если кофактор прочно связан с полипептидной цепью, он называется простетической группой . Между простетической группой и апоферментом – ковалентная связь.

Если кофактор легко отделяется от апофермента и способен к самостоятельному существованию, то такой кофактор называется коферментом.

Между апоферментом и коферментом связи слабые – водородные, электростатические и др.

Химическая природа кофакторовкрайне разнообразна. Роль кофакторов в двухкомпонентных ферментах играют:

1 – большинство витаминов (Е, К, Q, С, Н, В 1 , В 2 , В 6 , В 12 и др.);

2 соединения нуклеотидной природы (НАД,НАДФ, АТФ, КоА, ФАД, ФМН), а также целый ряд др. соединений;

3 – липолевая кислота;

4 – многие двухвалентные металлы (Мg 2+ , Mn 2+ ,Ca 2+ и др.).

Активный центр ферментов.

Ферменты – высокомолекулярные вещества, молекулярный вес которых достигает нескольких млн. Молекулы субстратов, взаимодействующих с ферментами обычно имеют гораздо меньший размер. Поэтому естественно предположить, что с субстратом взаимодействует не вся молекула фермента в целом, а только какая-то ее часть – так называемый «активный центр» фермента.

Активный центр фермента – это часть его молекулы, непосредственно взаимодействующая с субстратами, участвующая в акте катализа.

Активный центр фермента формируется на уровне третичной структуры. Поэтому при денатурации, когда третичная структура нарушается, фермент теряет свою каталитическую активность!

Активный центр в свою очередь состоит из:

1.каталитического центра, который осуществляет химическое превращение субстрата;

2.субстратного центра («якорной» или контактной площадки), которая обеспечивает присоединение субстрата к ферменту, формирование фермент-субстратного комплекса.

Четкую грань между каталитическим и субстратным центром провести можно не всегда – у некоторых ферментов они совпадают или перекрываются.

Помимо активного центра, в молекуле фермента существует т.н. аллостерический центр. Это участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому определенного низкомолекулярного вещества (эффектора), изменяется третичная структура фермента. Это приводит к изменению конфигурации активного центра и, следовательно, к изменению активности фермента. Это явление аллостерической регуляции активности фермента.

Многие ферменты являются мультимерами (или олигомерами), т.е. состоят из двух и более субъединиц- протомеров (аналогично четвертичной структуре белка).

Связи между субъединицами, в основном, не ковалентные. Максимальную каталитическую активность фермент проявляет именно в виде мультимера. Диссоциация на протомеры резко снижает активность фермента.

Ферменты – мультимеры содержат обычно четкое число субъединиц (2-4), т.е. являются ди- и тетрамерами. Хотя известны гекса- и октамеры (6-8) и чрезвычайно редко встречаются тримеры и пентамеры (3-5).

Ферменты-мультимеры могут быть построены как из одинаковых, так и из разных субъединиц.

Если ферменты-мультимеры образованы из субъединиц различных типов, они могут существовать в виде нескольких изомеров. Множественные формы фермента называют изоферментами (изоэнзимами или изозимами).

Например, фермент состоит из 4 субъединиц типов А и Б. Он может образовать 5 изомеров: АААА, АААБ, ААББ, АБББ, ББББ. Эти изомерные ферменты являются изоферментами.

Изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию, обычно воздействуют на один и тот же субстрат, но отличаются по некоторым физико-химическим свойствам (молекулярной массе, аминокислотному составу, электрофоретической подвижности и др.), по локализации в органах и тканях.

Особую группу ферментов составляют т.н. мультимерные комплексы. Это системы ферментов, катализирующих последовательные стадии превращения какого-либо субстрата. Такие системы характеризуются прочностью связи и строгой пространственной организацией ферментов, обеспечивающей минимальный путь прохождения субстрата и максимальную скорость его превращения.

Примером может служить мультиферментный комплекс, осуществляющий окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Комплекс состоит из 3-х видов ферментов (М.в. = 4 500 000).

Механизм действия ферментов

Механизм действия ферментов заключается в следующем. При соединении субстрата с ферментом образуется нестойкий фермент субстратный комплекс. В нем происходит активация молекулы субстрата за счет:

1. поляризации химических связей в молекуле субстрат и перераспределение электронной плотности;

2. деформации связей, вовлекаемых в реакцию;

3. сближения и необходимой взаимной ориентации молекул субстрата (S).

Молекула субстрат фиксируется в активном центре фермента в напряженной конфигурации, в деформированном состоянии, что приводит к ослаблению прочности химических связей и снижает уровень энергетического барьера, т.е. субстрат активизируется.

В процессе ферментативной реакции различают 4 этапа:

1 – присоединение молекулы субстрата к ферменту и образование фермент-субстратного комплекса;

2 – изменение субстрата под действием фермента, делающее его доступным для химической реакции, т.е. активизация субстрата;

3 – химическая реакция;

4 – отделение продуктов реакции от фермента.

Это можно записать в виде схемы:

E + SESES* EPE + P

где: Е – фермент, S – субстрат, S* - активизированный субстрат, Р – продукт реакции.

На 1-ом этапе к субстратному центру присоединяется с помощью слабых взаимодействий та часть молекулы субстрата, которая не подвергается химическим превращениям. Для образования фермент-субстратного комплекса (ES) необходимо соблюдение трех условий, которые и определяют высокую специфичность действия фермента.

Условия образования фермент-субстратного комплекса:

1.структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента. По выражению Фишера они должны подходить друг к другу, «как ключ к замку». Это подобие обеспечивается на уровне третичной структуры фермента, т.е. пространственного расположения функциональных групп активного центра.

2.электростатическое соответствие активного центра фермента и субстрата, которое обусловлено взаимодействием противоположно заряженных групп.

3.гибкость третичной структуры фермента – «индуцированное соответствие». Согласно теории вынужденного или индуцированного соответствия каталитически активная конфигурация молекулы фермента может возникать лишь в момент присоединения субстрата в результате его деформирующего воздействия по принципу «рука-перчатка».

Механизм действия однокомпонентных и двухкомпонентных ферментов аналогичен.

В образовании фермент-субстратного комплекса у сложных ферментов принимают участие и апофермент и кофермент. При этом субстратный центр располагается обычно на апоферменте, а кофермент принимает участие непосредственно в акте химического превращения субстрата. На последнем этапе реакции апофермент и кофермент выделяются в неизменном виде.

На 2 и 3 этапе превращение молекулы субстрата связано с разрывом и замыканием ковалентных связей.

После осуществления химических реакций фермент переходит в исходное состояние и происходит отделение продуктов реакции.

Способность фермента катализировать определенный тип реакции называют специфичностью.

Специфичность бывает трех видов:

1.относительная или групповая специфичность – фермент действует на определенный вид химической связи (например, фермент пепсин расщепляет пептидную связь);

2.абсолютная специфичность - фермент действует только на один строго определенный субстрат (например, фермент уреаза расщепляет амидную связь только в мочевине);

3.стехиометрическая специфичность – фермент действует только на один из стереоизомеров (например, фермент глюкозидаза сбраживает только D-глюкозу, но не действует на L-глюкозу).

Специфичность фермента обеспечивает упорядоченность протекания реакций обмена веществ.